應用驅動型qPCR儀選型攻略-9

四、TaqMan Array Card運行所需配套條件 

       TAC檢測本質上依然是TaqMan探針實時熒光定量PCR反應，只是反應承載介質不同。在操作流程中，核酸提純、反應條件設定及數(shù)據(jù)分析并無二致。區(qū)別首先是上文所議的TAC陣列布局設計，其次是點樣后的TAC處理環(huán)節(jié)。 

       簡單地說，TAC上機運行前，須完成以下5步操作： 

1） 上樣 

       移液槍頭吸取100 μL配好的PCR反應液（含TaqMan Universal PCR Master Mix和模板）注入TAC加樣孔（Fill port）。

2） 離心 

       將已上樣的TAC插入特制的TAC適配器（Card holder）中，加樣孔在上，反應孔朝向適配器有標記的一面。將適配器插入離心機水平轉頭吊籃，轉速1200rpm(相對離心力331×g)離心兩次，每次1分鐘。 

3） 密封 

       將完成離心的TAC放入專用封片機TAC Sealer，手工完成密封。 

4） 實時熒光定量PCR儀運行反應模塊設置 

       TAC與其它常規(guī)96/384孔反應板模塊，在儀器設置上有區(qū)別。 

       實驗前須確認儀器已安裝TaqMan Array Card反應模塊。然后在儀器設置環(huán)節(jié)選擇 “384 Wells TaqMan Low Density Array”或“TaqMan Array Card ”或“TLDA”。 

       正確選定反應模塊后，還需導入TAC樣品靶點設置信息對應的SDS Setup文件（SDS Setup文件包含了TAC反應孔靶位排列設置信息。文件可以被直接導入軟件），完成反應板的設置（相當于常規(guī)qPCR的plate setup操作）。 

5） 按儀器使用說明完成其它設置，運行實驗并分析實驗數(shù)據(jù)。 

       上述操作流程中，須有以下配置要素支持，這是前提。 

4.1 配置TAC模塊的實時熒光定量PCR儀 

       綜合目前Applied Biosystems一系列技術文件，確認以下Real-Time PCR System可用于TAC檢測，包括： 

       7900HT Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)； 

       ViiA 7實時熒光定量PCR系統(tǒng)： ViiA 7 Real-Time PCR System with TAC block（4453537）、ViiA 7 Dx（臨床診斷型）； 

       QuantStudio 7 Pro實時熒光定量PCR系統(tǒng)：QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System with TAC block（A43186、A43165）； 

       QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)：QuantStudio 7 Flex with TAC block(4485700、4485696)； 

       QuantStudio 12K Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)：QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System with TAC block(4471089)；

       QuantStudio Dx實時熒光定量PCR系統(tǒng)； 

       TAC專用反應模塊（TaqMan Array Card Block，TAC sample block）工作套件包括TAC模塊熱蓋（384-Well/Array Card Heated Cover）、TAC模塊基座(Array Card Sample Block)和TAC模塊適配器（Array Card Adapter)三個部件。因不同機型安裝接口不完全一致，適用的TAC反應模塊不完全兼容。 

       上述機型若未選配TAC Block，則需添加相應TAC升級包才能實現(xiàn)TAC檢測功能，詳情見表2。 

表2 Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀TAC專用升級包

         升級包中配置了一個TAC樣品模塊, 一個TAC專用密封器（TaqMan Array Card sealer）和TAC離心專用套件（Array Card Bucket/Clip Set）。TAC離心套件須在滿足特定配置要求的離心機才能運行。

          目前，除賽默飛TX-750水平轉頭外，eppendorf公司為5920R大容量臺式離心機開發(fā)了兩種TAC離心專用適配器。5920749005型適配器（2個/套）適用于S-4xUniversal-Large水平轉子套件（5895190006）；5825759001則需在S-4x1000轉子吊籃套件（5895118003）中使用。每個適配器同樣可固定3塊TAC板，4個適配器同時使用最多可離心12塊TAC。

4.2 專用離心機和配套轉頭 

       ABI為TAC離心所定制的套件包括Array Card Centrifuge Bucket 75015679和Array Card Holders 75015686（即Array Card Clip或Array Card Adapter），介紹此處從略，可點擊鏈接了解詳情。 

       據(jù)2021版官方資料，TAC離心套件是依托4×750mL水平轉頭TX-750(75003180)、TTH-750(75006445/75006434)開發(fā)的。它適用于以下型號賽默飛離心機： 

       Multifuge X4 Pro、Multifuge X4R Pro高通量高速低溫離心機 

       Sorvall ST4 Plus、Sorvall ST4R Plus高通量低溫離心機 

       Megafuge ST4 Plus、Megafuge ST4R Plus臺式大容量離心機 

       Sorvall X4 Pro、Sorvall X4R Pro臺式高通量離心機 

       Megafuge 40、Megafuge 40R臺式大容量高速冷凍離心機 

       Multifuge X3、Multifuge X3R臺式大容量高速冷凍離心機 

       Sorvall ST 40R臺式低溫高速離心機 

       Sorvall Legend XT、Sorvall Legend XTR低溫高速離心機 

       Sorvall Legend T Plus、Sorvall Legend RT Plus低溫高速離心機 

       SL40、SL40R臺式大容量高速冷凍離心機 

       官方技術指南要求的TAC最大離心轉速 1200rpm，與此對應最大相對離心力rcf 為331×g,離心2次，每次離心1分鐘，并確保轉速控制在指定范圍。 

       國內(nèi)外部分文章中把離心轉速/離心力寫成12000xg或1200xg，顯然有誤。

五、關于TaqMan Array Card方法應用的幾點共識 

1）門庭冷落車馬稀 

       TAC檢測的高時效性、高通量性、高可靠性和高穩(wěn)定性表現(xiàn)，已被近20年來臨床、醫(yī)學、生物學研實踐所證明。然而PubMed數(shù)據(jù)顯示， [Text Word]為檢索范圍，2006年1月-2022年2月，所有與TAC應用有關的論文總數(shù)僅區(qū)區(qū)1745篇。 

       另一方面，在ABI ViiA7上市前的2004-2010年，單依托7900HT Fast 實時熒光定量PCR系統(tǒng)發(fā)表實驗論文就多達4538篇。說明：在7900HT Fast用戶中，僅有不到40%的實驗室開展了TAC實驗。從TAC上市至今，其公開發(fā)表的應用案例數(shù)量（注：核查后實際數(shù)量比PubMed檢索的條目數(shù)少），與基于7900HT Fast、ViiA 7、QuantStudio 12K Flex、QuantStudio 7 Flex、QuantStudio 7 Pro系列實時熒光定量PCR儀開展Taqman探針實驗的論文基數(shù)比，簡直可以忽略。 

       委實一派曲高和寡、叫好不賣座的慘象。 

2） 梅須遜雪三分白,雪卻輸梅一段香 

       澳大利亞莫納什大學科研人員，用TAC和常規(guī)qPCR方法完成了一項對墨爾本市政廢水及斐濟籍定居者定居點人、動物和環(huán)境樣本中病原體的流行病學調(diào)查。在2021年5月Lancet Planet Health（IF19.17）的刊文中，對TAC方法與標準qPCR法的測試表現(xiàn)做了評價。對于添加基因片段的不含PCR抑制劑的樣本基質，兩種檢測方法的特異性 (TAC 100%，qPCR 94%)、敏感性(TAC 92%，qPCR 100%)和定量準確性(TAC 91%，qPCR 99%)相似。對取自實際居住點環(huán)境樣品中的8個腸道病原體靶點檢測，兩種技術定量結果一致性為89%。常規(guī)qPCR方法在檢測敏感性、準確性和耐受樣本中PCR抑制劑干擾能力更勝一籌。 

       事實上，國內(nèi)外眾多刊文都提到，TAC檢測靈敏度、LOD性能指標不及常TaqMan探針熒光定量法,對核酸樣品純度和品質要求極嚴。因此，靶點豐度瀕臨TAC的LOD的測試樣品，極有可能出現(xiàn)摸棱兩可或假陰性結果。
       TAC方法的長項在于一石多鳥，快刀斬亂麻。該方法有利于人們在彌天大霧中，快速確定方向、縮小搜索范圍并鎖定目標。因此，可極大降低實驗人力和時間耗費，加快探索進程，這是其核心價值。

3） 北畔是山南畔海，只堪圖畫不堪行 

       Lancet Planet Health一文中“Table 3: Comparison of TAC and qPCR for monitoring multiple pathogens”所提供的TAC實驗成本測算數(shù)據(jù)顯示：常規(guī)qPCR法檢測中，每種靶標不設重復情況下，試劑成本約為2.10美元。樣品數(shù)量增加所致試劑開支增加很少。但若靶標設置為2個技術重復，則人工和試劑成本翻倍。而TAC測試，每個樣品的試劑成本約60美元，分攤到每個靶標后，試劑成本約1.28美元。 

       2020年，有國內(nèi)學者指出：TAC單孔檢測成本約是普通PCR板介質qPCR實驗的8倍。 

       若以Format 24型Custom Gene Expression TaqMan Array Card（4342249）來估算，每個靶標設置2個重復、測試23個靶基因表達水平，不計前期mRNA提取純化、cDNA反轉錄、PCR預混液準備環(huán)節(jié)試劑開支，單是TAC定制成本就2.8萬元，折合每張TAC造價近2800元以上。再加上樣品準備階段TaqMan 2×?Universal PCR master mix、RNA-to-cDNA反轉錄等必須試劑開支，每個樣品測試成本得超350元，這個價與國外報道的結論吻合。

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