應(yīng)用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-8 

       普通PCR實驗是每個反應(yīng)孔中用一組特異性引物對一種靶基因片段的擴增，為單靶標(biāo)或單重PCR反應(yīng)（singleplex PCR/uniplex PCR/Monoplex PCR）。多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction/Multiplex PCR，mPCR）是指每個 PCR 反應(yīng)孔中混合使用兩組或多組不同引物，在單一PCR反應(yīng)中同時對多個DNA模板（Multiple Template PCR Reaction）或同一長DNA序列模板的不同區(qū)域（Single Template PCR Reaction）擴增的PCR反應(yīng)。1988年，美國分子遺傳學(xué)家首創(chuàng)多重PCR方法，應(yīng)用于產(chǎn)前、產(chǎn)后的杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（DMD）篩查診斷，在一個反應(yīng)孔中用6組引物對抗肌萎縮蛋白基因的6個易缺失外顯子片段進行擴增。 

       將多重PCR技術(shù)作為內(nèi)核，與凝膠電泳或毛細管電泳分析結(jié)合，構(gòu)成完整多重PCR分析（Multiplex PCR Assay）流程，可用于感染性疾病的篩查與鑒別診斷、遺傳疾病診斷、細菌耐藥基因檢測、物種鑒定分型、基因克隆篩選、基因突變與缺失檢測、基因分型、基因修復(fù)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制等研究。 

       把多重PCR反應(yīng)作為基礎(chǔ)步驟，整合進NGS測序、染色體免疫共沉淀多重PCR分析（ChIP-mPCR）、多重連接探針擴增技術(shù)(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)、滾環(huán)DNA擴增技術(shù)( rolling circle DNA amplification, RCA) 、SNP panel identification assay (SPIA)，多重串聯(lián)PCR（Multiplex Tandem PCR/MT-PCR)、多重PCR /液相色譜聯(lián)用分析法(multiplex PCR/liquid chromatography assay，MP/LC)等檢測流程，早已在基因文庫制備、多位點STR、SNP基因突變分析等研究中得到應(yīng)用。 

       而多重PCR與實時熒光定量PCR相結(jié)合，使多重實時熒光PCR分析技術(shù)（multiplex real-time PCR assay）破繭而出。

一、多重實時熒光PCR與多重PCR概念不同

       PubMed檢索數(shù)據(jù)顯示，2016.01-2021-11期間，標(biāo)題中含multiplex PCR的實驗文章共311篇，包括Nat Protocol（IF13.491，1篇）、Acta Pharm Sin B（IF11.413，1篇）、Crit Care（IF9.094，3篇）、Clin Microbiol Infect（IF19.074，2篇）、EBioMedicine（IF8.143，1篇）、Microbiol Spectr（IF7.172，2篇）。僅4篇文章標(biāo)題用multiplex PCR但實際用的是實時熒光定量PCR方法（Biofire FilmArray Multiplex PCR、Anyplex II RV16、Multicolor melting curve analysis和Color-coded molecular beacons）法。

       以multiplex PCR[Body - Key Terms] AND "Nucleic Acids Res"[Journal]檢索獲得多重PCR實驗文章共61篇。其中6篇用的是多重實時熒光定量PCR分析法，在“材料和方法”中標(biāo)明為quantitative reverse transcriptase multiplex PCR、quantitative multiplex PCR、Real-time multiplex assays、Multiplex quantitative PCR、Quantitative real-time multiplex fluorogenic PCR及multiplex real-time PCR。僅1篇文中使用“For multiplex PCR 200 nM of each primer (HT17, NR24 and BAT26) was added”表述，而附表1: “List of primers used”顯示，實驗是FAM熒光標(biāo)記引物加溶解曲線分析的實時熒光PCR方法。

       這表明，超過98%的研究人員對multiplex PCR和multiplex real-time PCR在概念上是有嚴(yán)格區(qū)別的。多重實時熒光定量PCR分析法用的是quantitative multiplex PCR、multiplex real-time PCR assay類似表述，而非常規(guī)多重PCR的multiplex PCR assay或mPCR。 

二、多重實時熒光定量PCR分析的應(yīng)用優(yōu)勢

       在多重PCR中，通過在反應(yīng)中包含一對以上的引物，可以擴增出多個目標(biāo)序列。多重PCR有潛力在實驗室內(nèi)節(jié)省大量的時間和精力，而不影響檢測效用。多重實時熒光PCR分析融合了多重PCR和實時熒光定量PCR兩種技術(shù)方法的天然優(yōu)勢發(fā)展起來的，具有快速高效、特異性強、靈敏度高的特點。 

1. 內(nèi)部參照（Internal Control，IC）優(yōu)勢

       常規(guī)單重實時熒光定量PCR實驗中設(shè)有單獨的內(nèi)參反應(yīng)孔，一是檢驗擴增條件的可行性（評估PCR擴增條件和實驗設(shè)置有效性、擴增效率、PCR反應(yīng)抑制程度和PCR反應(yīng)假陰性鑒別等），二是用于對各樣品檢測數(shù)據(jù)的歸一化（消除不同反應(yīng)孔初始樣本量、樣品準(zhǔn)備過程差異對結(jié)果的影響）。

        在多重實時熒光PCR分析中，多個模板是在同一個反應(yīng)孔中、在相同條件下平行擴增，每個擴增子為其他擴增子提供了一個內(nèi)部對照，便于鑒別潛在的PCR反應(yīng)失敗引起的假陰性問題。

        在基因缺失的多重PCR檢測中，多個外顯子被擴增。除非被掃描的整個區(qū)域缺失，否則只要有部分片段的得以成功擴增，就足以表明擴增反應(yīng)沒有問題。所檢測到的DNA片段缺失是真實的遺傳性缺失而非檢測技術(shù)的局限、錯誤等導(dǎo)致的假缺失。  

2. 高效率低耗費優(yōu)勢

       用相同樣品、相同反應(yīng)體積時，單一模板的多重實時熒光PCR反應(yīng)，只需提取一次核酸。一個反應(yīng)孔相當(dāng)于完成了常規(guī)單重PCR數(shù)孔的檢測任務(wù)，樣品與試劑消耗、PCR體系構(gòu)建準(zhǔn)備工作量與時間投入都顯著減少。

       當(dāng)臨床樣本難以收集或所獲的樣品體積受限（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病采集的脊髓液、孕婦羊水標(biāo)本等），或當(dāng)多個可導(dǎo)致同一臨床表現(xiàn)的不同病原體感染疾病的篩查，單次采樣檢測多個致病靶點，可在短短2-3小時內(nèi)實現(xiàn)疾病快速、精準(zhǔn)診斷，有利于及時啟動針對性治療和傳染性疾病的防控措施。

       雙重實時熒光定量PCR反應(yīng)是在同一反應(yīng)孔同時擴增靶序列和內(nèi)參，較常規(guī)兩種序列分開在兩個單獨孔中進行單重反應(yīng)，反應(yīng)板樣品通量提高2倍。同時，每個反應(yīng)孔都減少一半樣本和試劑用量。若將兩個檢測靶標(biāo)與一個內(nèi)參組合進行三重實時熒光定量反應(yīng)，則樣本用量和試劑用量將進一步降低。 

3. 反應(yīng)模板質(zhì)量的可靠指示能力（Indication of Template Quality）

       PCR反應(yīng)的理論效率為100%，表示在指數(shù)擴增階段每次熱循環(huán)后的擴增產(chǎn)物數(shù)量翻倍。但擴增片段的長度、GC含量、反應(yīng)中各組分的濃度以及聚合酶品質(zhì)等諸多因素影響，導(dǎo)致實際PCR反應(yīng)效率低于 90%。

       因生物樣品本身就可能含有抑制逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的多種成分，如動物肌肉中的肌紅蛋白、尿素，植物組織中的多糖多酚等。多種常用的核酸提取純化試劑，如苯酚、氯仿、SDS等能抑制Taq酶的活性。抑制劑殘留過多的低純度反應(yīng)模板，會抑制PCR反應(yīng)，使得擴增效率超過 110%。通常，抑制劑在高濃度模板中的濃度高，PCR抑制作用強；模板稀釋后抑制劑濃度下降，抑制作用隨之減弱。

       因此，當(dāng)擴增效率＞110%或＜90%，說明PCR效率存在異常。

       此外，反應(yīng)模板如有降解，則引物無法有效退火步驟穩(wěn)定與目標(biāo)區(qū)域結(jié)合，也會造成擴增效率下降。因此，高品質(zhì)的反應(yīng)模板是確保實時熒光定量PCR反應(yīng)效率、檢測靈敏度、定量準(zhǔn)確性和定量檢測線性范圍的基本要求。

       多重PCR反應(yīng)比單重PCR反應(yīng)能更有效地反映模板質(zhì)量。

       在多重反應(yīng)中，模板發(fā)生降解后，會出現(xiàn)長片段的擴增信號比較短目標(biāo)序列信號弱的征象。此外，PCR抑制劑導(dǎo)致的擴增效率降低通過高豐度對照序列擴增損失和參考標(biāo)準(zhǔn)曲線實驗中豐度極低靶序列的擴增效果予以判別。 

4. 模板定量的精度優(yōu)勢

       多重實時熒光定量PCR實驗須將檢測目標(biāo)序列擴增數(shù)據(jù)用內(nèi)參對照測試值做歸一化處理和分析。

       PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備過程中移液精度波動、儀器熱循環(huán)模塊反應(yīng)孔間溫度均一性和模塊溫控精度誤差等客觀因素制約，即便同一個樣品分散在多個不同反應(yīng)孔中進行單重PCR擴增時，triplicate或quadruplicate技術(shù)重復(fù)的孔間檢測數(shù)據(jù)往往也不一致。同理，將待測靶點與內(nèi)參分開各自獨立擴增取得的初始數(shù)據(jù)歸一化結(jié)果，與二者合并執(zhí)行多重PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，存在差異是毋庸置疑。而且數(shù)據(jù)差異程度會因操作誤差和儀器溫控性能區(qū)別而異。

       目標(biāo)序列和內(nèi)參合并執(zhí)行多重實時熒光定量PCR反應(yīng)的優(yōu)勢顯而易見。由于同一反應(yīng)孔中的靶點和內(nèi)參數(shù)據(jù)源于一次加樣，PCR體系構(gòu)建中加樣操作誤差對靶標(biāo)和內(nèi)參的影響均衡化。用同一反應(yīng)孔的內(nèi)參對靶點標(biāo)準(zhǔn)化所得數(shù)據(jù)，比利用單重PCR反應(yīng)獲得的結(jié)果，誤差小，精度理應(yīng)更高。 

對于高精度定量實驗，如拷貝數(shù)變異（copy number variation ,CNV）分析實驗，模板拷貝數(shù)具有2倍差異時，7300、7500實時熒光定量PCR儀檢測精度就夠。但區(qū)分1.5倍的拷貝數(shù)差異，就需用QuatiStudio 3、QuatiStudio 5、QuatiStudio 6 pro和ViiA7這類有更高分辨精度的熒光定量平臺。而多重實時定量PCR分析更有利于達到所這類實驗所需的辨別精度。

       多重實時熒光定量 PCR實驗技術(shù)以來，在基因缺失分析、突變和多態(tài)性分析、表達分析和RNA檢測等應(yīng)用方興未艾。上至Nature、Lancet、Mol Cancer、Neuron、Nucleic Acids Res、Nat Commun、Eur J Hum Genet、J Exp Med、PANS，下至J Clin Microbiol、PLoS One、Am J Pathol、J Mol Diagn等，刊發(fā)的Multiplex Quantitative Real-Time PCR assays實驗論文浩如煙海。

表1 multiplex real-time PCR assay應(yīng)用實例舉隅

 （未完待續(xù)）