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實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)雙溫循環(huán)法的合理性及局限性
應(yīng)用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-5
常規(guī)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)過程無法監(jiān)測，只有PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過凝膠電泳條帶圖像分析、Southern Blot等方法，可對擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析。因此，相對于實(shí)時(shí)熒光PCR，人們把常規(guī)PCR稱為終點(diǎn)PCR (Endpoint PCR)。終點(diǎn)PCR擴(kuò)增程序通常由經(jīng)典的變性-退火-延伸三個(gè)溫度步驟循環(huán)組成。
適宜退火溫度可確保產(chǎn)物擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增產(chǎn)能。而有種說法是，PCR反應(yīng)的退火溫度與最適宜溫度條件差1℃，會造成非特異性產(chǎn)物的含量升高4倍。故人們歷來對PCR反應(yīng)退火溫度的選擇、退火和延伸步驟時(shí)長的設(shè)置慎之又慎。
但實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的情況似乎不一樣。擴(kuò)增片段長短、引物序列組成和長度差異形形色色，但不管起始模板是cDNA還是基因組DNA，報(bào)告熒光基團(tuán)是SYBR Green I抑或TaqMan探針與FRET雙雜交探針，取材來自動植物、微生物抑或臨床組織樣品，是進(jìn)行單重?zé)晒鈾z測還是multiplex多重?zé)晒夥治?，反?yīng)條件經(jīng)常是95℃- 60℃兩個(gè)溫度循環(huán)40次的程序設(shè)置。給人感覺：PCR擴(kuò)增條件按實(shí)時(shí)定量PCR用60℃標(biāo)準(zhǔn)溫度就可以，優(yōu)化引物退火溫度多此一舉，可以休矣。
表1 two-temperature PCR protocols
反應(yīng)類型 | PCR熱循環(huán)條件 | 備注 | 文獻(xiàn)出處 |
endpoint PCR | 1 min - 95℃→ 1 min - 58℃→ 1 min - 72℃ 25 cycles | - | Magdalena C Liebl, et al. Nucleic Acids Res. 2021; 49(5): 2759–2776 |
RT-qPCR | 95℃ - 5 min; 95℃ - 5 s → 60℃ - 30s，40 cycles | SYBR Green I dye LightCycler 480 or CFX384 Touch Real-Time PCR System | |
RT-qPCR | 3 min - 95℃ 95℃ - 15 s →60℃ - 45 s，40 cycles | SYBR Green I dye CFX96 Real-Time PCR System | Zheng-Wei Fu, etal. Nucleic Acids Res. 2021; 49(4): 1886–1899 |
RT-qPCR | 95℃ - 10 minutes; 95℃ - 15 s → 60℃ - 60s，40 cycles | SYBR Green I dye ViiA7 Real-Time PCR System | Ross J Hill, et al. Nat Genet. 2019; 51(8): 1283–1294 |
95℃ - 10 minutes; 95℃ - 15 s → 60℃ - 60s，40 cycles | TaqMan probes ViiA7 Real-Time PCR System | ||
RT-qPCR | 50℃–2min → 95℃ - 10min; 95℃–15sec → 60℃- 1min，40 cycles | SYBR Green I dye or TaqMan Probe ViiA7 Real-Time PCR System | Britta Will, et al. Nat Med. 2015; 21(10): 1172–1181 |
Duplex | 50℃- 2min → 95℃- 10min; 95℃ - 15s →60℃ - 60s，40 cycles | ViiA7 Real-Time PCR System | Luca Perico, et al. Nat Commun. 2017; 8: 983 |
Duplex | 95℃- 10 min； 15s - 95℃ → 60s - 60℃，40 cycles | ViiA7 Real-Time PCR System | Scott Gettinger, et al. Cancer Discov. 2017; 7(12): 1420–1435 |
triplex | 30 min - 42℃, 10 min - 95℃； 95℃ - 15s → 58℃- 45s，40 cycles Plate-reading during the 58℃ phase | 7300 Real-Time PCR System | Roujian Lu, et al. Lancet. 2020 22-28; 395(10224): 565–574 |
triplex | 50℃ - 2 min, 95℃ - 10 min; 95℃ - 15sec → 60℃ - 60s，40 cycles | TaqMan probes Real-Time PCR System | Matthias Lübbert, et al. Neuron. 2019; 101(2): 260–273.e6 |
triplex | 94℃ - 10 min; 94℃ - 30s → 62℃ - 45s，45 cycles | LightCycler 480 Real-Time PCR System | Yongqing Tong, et al. J Exp Clin Cancer Res. 2018; 37: 68 |
triplex | 95℃- 20s; 95℃- 1s → 60℃- 20s，40 cycles | StepOnePlus Real-Time PCR System | Karolina A. Rygiel, et al Nucleic Acids Res. 2016; 44(11): 5313–5329 |
quadruplex | 94℃- 10 min; 94℃ - 15s→60℃ - 60s，40 cycles | QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Christian Gaebler, et al. J Exp Med. 2019; 216(10): 2253–2264 |
endpoint PCR | 95℃ - 3 min; 95℃ - 30s →68℃-30s→72℃-30s，35 cycles；5 min - 72℃ elongation | - | Behnoush Hosseini, et al. PLoS One. 2021; 16(9): e0257225 |
quadruplex | 95℃- 3 min; 95℃ - 15s → 60℃ - 45s，40 cycles | SensiFAST Probe CFX96 Real-Time PCR system |
同是進(jìn)行DNA序列熱循環(huán)擴(kuò)增，為何實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀放棄成熟的變性-退火-延伸三溫循環(huán)法，啟用95℃-60℃兩個(gè)溫度循環(huán)反應(yīng)程序？這個(gè)貌似 “標(biāo)準(zhǔn)化”的PCR protocol從何而來，是TaqMan探針擴(kuò)增必然要求，還是受熒光信號檢測技術(shù)所限不得已而為之？沒有雙溫循環(huán)法qPCR還能做嗎?
一、雙溫度循環(huán) PCR程序源自ABI早期TaqMan探針應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)
如《實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀熒光檢測技術(shù)融合趨勢雜談》所述，是ABI為TaqMan探針技術(shù)落地與應(yīng)用創(chuàng)建了一整套標(biāo)準(zhǔn)體系，并在ABI PRISM 7700 Sequence Detection System原型機(jī)上驗(yàn)證成功。這套體系包括了Primer Express software工具軟件、引物探針設(shè)計(jì)法則、探針檢測PCR反應(yīng)條件等內(nèi)容。
將退火、延伸步驟整合，并用低于探針Tm的溫度作為退火-延伸共享溫度（combined annealing/extension temperature）這一方法，可兼顧引物與模板復(fù)性與延伸、探針與模板穩(wěn)定雜交和探針5′端的水解這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)的技術(shù)要求。同時(shí)，通過優(yōu)化反應(yīng)體系中MgCl2濃度，保持探針在較高溫度下的雜交穩(wěn)定性，盡可能地提升AmpliTaq Gold酶合成效能。據(jù)此確立了由95℃變性和55℃-62℃退火/延伸1分鐘兩個(gè)溫度循環(huán)的qPCR擴(kuò)增程序（ two-temperature PCR protocol）。
在正式ABI PRISM 7700熒光定量PCR儀的運(yùn)行編程初始模板中，為TaqMan探針定制的熱循環(huán)條件是：
HOLD階段：10 min，95℃
CYCLE階段：Melt step 95℃ - 15 sec，Anneal/Extend step：60℃ - 1 min, 40 Cycles.
其雙溫循環(huán)（two-temperature cycle）包括了一個(gè)95℃長15秒的雙鏈熔解（變性）溫度步驟 (denaturation or melting step)和一個(gè)60℃長1分鐘的退火-延伸步驟（anneal-extension step）。
眾所周知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀與終點(diǎn)PCR儀運(yùn)行機(jī)制的最大區(qū)別是實(shí)時(shí)采集每一輪熱循環(huán)中的熒光信號。ABI確定以退火-延伸步驟采集的TaqMan探針熒光數(shù)據(jù)作為分析依據(jù)。
為了確保熒光數(shù)據(jù)采集的準(zhǔn)確性，7700系統(tǒng)將經(jīng)典PCR三溫度循環(huán)中引物退火和延伸兩步合并為退火/延伸一步，這樣設(shè)計(jì)是便于延長共享溫度步驟的維持時(shí)間，目的是給CCD的多點(diǎn)熒光數(shù)據(jù)采集提供足夠周轉(zhuǎn)時(shí)間（可參《實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測通道數(shù)量擴(kuò)充的革命來啦？》）。
從7700到隨后的7300、7500、StepOnePlus，從Viia7到Quantstudio 5、Quantstudio 6 Pro、Quantstudio 7 Flex，初始編程模板始終是雙溫循環(huán)設(shè)置，所不同的只是退火-驗(yàn)收步驟中時(shí)間長短有變化。
ABI處心積慮、另辟蹊徑開發(fā)這一檢測方法，是為從TaqMan探針應(yīng)用技術(shù)專利中切自己那份蛋糕。這毋庸置疑，也合情合理。
用ABI技術(shù)和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)下的商品化引物、TaqMan探針試劑和雙溫循環(huán)法擴(kuò)增，多數(shù)情況下，均可獲得良好擴(kuò)增效果。憑借ABI在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)地位，TaqMan探針檢測擴(kuò)增程序因qPCR儀推廣而迅速普及。
人們照貓畫虎，將TaqMan探針實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增方法拓展到SYBR GRREN I檢測中并取得成功，從而造就了如今雙溫循環(huán)法漫天飛舞的盛景。
二、雙溫度循環(huán)擴(kuò)增法并非法定qPCR實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)
資料表明，95℃-60℃兩步溫度循環(huán)程序并非正式行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。眾多實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀廠商也沒有將其引入系統(tǒng)初始Protocol設(shè)置。
羅氏是TaqMan探針5′nuclease assay技術(shù)、PCR核心方法專利所有者，但LightCycler系列定量PCR儀的experiment protocol設(shè)定環(huán)節(jié)，program（步驟）、temperature Target（目標(biāo)溫度）和hold time參數(shù)都是開放的。
伯樂Icycler IQ系統(tǒng)在運(yùn)行設(shè)置初始模板中曾引入了雙溫循環(huán)設(shè)置。但從CFX 96開始，如CFX 96-Touch、CFX Opus 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等，系統(tǒng)運(yùn)行編程界面已恢復(fù)到用戶自主設(shè)定PCR反應(yīng)步驟和溫度的界面模式。
Agilent Stratagene MX3000P、Mx3005P運(yùn)行設(shè)置中，初始模板用的依然是95℃變性-55℃退火-72℃延伸的經(jīng)典三溫循環(huán)編程設(shè)置。
這說明，qPCR實(shí)驗(yàn)中，雙溫循環(huán)擴(kuò)增法的應(yīng)用在業(yè)內(nèi)并未完全取得一致，是有保留的。
三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)雙溫循環(huán)法的合理性及局限性
TaqMan熒光探針信號檢測是基于5′核酸酶降解與模板結(jié)合DNA的原理。PCR反應(yīng)條件須同時(shí)滿足四個(gè)要素：
1）引物與模板穩(wěn)定結(jié)合并得以正常延伸；
2）探針與模板結(jié)合才能被降解，故PCR延伸過程須在確保探針特異性結(jié)合的溫度下進(jìn)行；
3）引物的延伸順利延伸至探針5′端；
4）探針被切除釋放熒光信號。
qPCR技術(shù)創(chuàng)立早期實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)擴(kuò)增片段較小，且引物退火溫度與延伸溫度相差不超過3°C情況下，95℃的變性步驟不變，而退火、延伸兩步合并為60℃一步的改良可行。
與此同時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)該方法的以下特征：
特征1 酶活性不夠時(shí)間補(bǔ)
60℃明顯低于70-72℃的AmpliTaq金牌酶活性最佳溫度范圍。聚合酶活性降低會造成引物延伸效能下降，用的是延伸時(shí)間適度延長的辦法予以彌補(bǔ)。
特征2 溫度高了MgCl2頂
60℃可能比引物-模板特異性結(jié)合溫度高，通過改進(jìn)PCR反應(yīng)組份引物濃度和優(yōu)化體系組份的方法可以克服。而此溫度條件無疑有助于限制非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，增加PCR反應(yīng)的特異性。
特征3 以效率代價(jià)換專利
雙溫循環(huán)法qPCR擴(kuò)增程序本質(zhì)上是赤裸裸地以犧牲PCR擴(kuò)增效能為代價(jià)，來換取TaqMan熒光探針檢測技術(shù)專利的確立。但技術(shù)上總歸是有缺陷的。
從表1 Behnoush Hosseini等報(bào)道的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，完成同一個(gè)片段的擴(kuò)增，終點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)采用三溫循環(huán)法只需35個(gè)循環(huán)即可達(dá)到擴(kuò)增產(chǎn)物檢測用量要求，而在qPCR的雙溫循環(huán)法擴(kuò)增要40個(gè)循環(huán)才能出現(xiàn)陽性結(jié)果。
人們其實(shí)早就認(rèn)識到，雙溫循環(huán)法有其明確“適用癥”限制，它并非包治百病適用于所有靶片段擴(kuò)增。譬如于長片段樣品，雙溫循環(huán)法存在擴(kuò)增效率低、穩(wěn)定性和重復(fù)性差的問題。有相當(dāng)一部分實(shí)驗(yàn)采用雙溫循環(huán)擴(kuò)增方法存在困難，且不容易通過優(yōu)化反應(yīng)條件、加長延伸時(shí)間有效克服。原因可能是兩步循環(huán)擴(kuò)增法常用的退火、延伸的溫度和時(shí)間設(shè)置影響了引物的擴(kuò)增效果有關(guān)。
在對白酒發(fā)酵菌Lactobacillus sp.的一段445 bp片段的熒光PCR對比實(shí)驗(yàn)表明，采用傳統(tǒng)變性、退火、延伸三步循環(huán)擴(kuò)增法，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定性高，擴(kuò)增線性強(qiáng)，檢測靈敏度高。
結(jié)果顯示，三溫循環(huán)擴(kuò)增法每個(gè)循環(huán)時(shí)間僅多出25s，加上從55℃退火→ 72℃延伸升溫過程耗時(shí)（按4℃/s變溫速率計(jì)算），完成40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增總耗時(shí)比雙溫循環(huán)法多出不過20分鐘而已。對符合科研假說的完美陽性結(jié)果孜孜以求的科研人員來說，20分鐘實(shí)驗(yàn)延時(shí)有那么難以忍受嗎？何況，若采用表1文獻(xiàn)中大部分兩步法擴(kuò)增退火/延伸時(shí)間維持45s-60s重新評估，單次循環(huán)中兩種擴(kuò)增法耗時(shí)差距縮短至10s，完成兩種實(shí)驗(yàn)程序時(shí)長差距將無足輕重。
表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中三步溫度循環(huán)擴(kuò)增程序
反應(yīng)類型 | PCR熱循環(huán)條件 | 備注 | 文獻(xiàn)出處 |
RT-qPCR | 95℃ - 20 s → 60℃ - 20 s → 72℃ - 20 s 45 cycles | SYBR Green I dye Lightcycler 480 II Real-Time PCR System | Seungwoo Cha, et al. Nucleic Acids Res. 2021; 49(2): 745–759 |
RT-PCR | 95℃ - 3 min; 98℃ - 10 s →60℃ - 30 s →72℃ - 6 min 22 cycles | - | Minoru Kubo, et al. Nucleic Acids Res. 2019; 47(9): 4539–4553 |
endpoint PCR | 98 ℃ 1 min 98℃- 10s → 55℃ - 30s → 72℃ - 25s，40 cycles | - | 杜如冰,等. 微生物學(xué)通報(bào), 2020, 47(1): 1-12. |
qPCR | 98 ℃ 1 min 98℃ - 10s → 60℃ - 30s，40個(gè)循環(huán) | SYBR Green I dye ABI Real-Time PCR System |
即便是雙溫循環(huán)法的qPCR實(shí)驗(yàn)，也并非千篇一律用95℃、60℃這兩個(gè)循環(huán)溫度。部分論文中采用的是變性94℃、退火延伸58℃方案（見表1）。
實(shí)際上，市面部分實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針 (TaqMan，Molecular Beacon等)用的預(yù)混試劑，因60℃會抑制所用的熱啟動酶活性，擴(kuò)增只能采用三步溫度循環(huán)法進(jìn)行。
四、小結(jié)
實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)與普通終點(diǎn)PCR，無論是否加入熒光染料、熒光探針檢測，本質(zhì)都離不開對靶序列的高效、特異性擴(kuò)增，故經(jīng)典變形-退火-延伸三個(gè)溫度步驟循環(huán)法，都是適用的。
95℃變性-60℃退火/延伸雙溫度循環(huán)法，是人們遵從體外PCR客觀規(guī)律基礎(chǔ)上、在巨大商業(yè)利益驅(qū)動下催生的。應(yīng)秉持科研探索精神，取其精華去其糟粕，正視其特殊應(yīng)用價(jià)值，但不可一葉障目并為之自縛手腳。
參考文獻(xiàn)
［1］ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual(904989B,01/2001)
［2］LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5
［3］CFX Opus 96 and CFX Opus 384 Real-Time PCR Systems Instrument Guide
［4］MxPro QPCR Software Instruction Manual For Mx3000P and Mx3005P QPCR Systems(Software version 4.10)
［5］杜如冰, 吳群, 徐巖. 基于三步熒光定量PCR技術(shù)揭示不同產(chǎn)區(qū)白酒釀造系統(tǒng)中Lactobacillus sp.的分布特征. 微生物學(xué)通報(bào), 2020, 47(1): 1-12.
